Métodos de diagnóstico microbiológico

Existen 2 métodos de diagnóstico microbilógico: los directos y los indirecto.

Los métodos directos tienen como objetivo primordial identificar al microorganismo específico que está causando el daño o la patología, mientras que los métodos indirectos buscan la manifestacion de una patología basado en la respuesta del sistema inmune, con la busqueda de antígenos o anticuerpos.

Según su clasificación podemos encontrar:

A. Métodos Directos:

I Tradicionales.

- Observación microscópica.
- Cultivo.
- Identificación.

II Moleculares.

- Hibridizacion
- P.C.R.

III Detección de antígenos:

- Inmunofluorescencia directo
- Elisa directo

B. Métodos indirectos:

- I. F.
- Elisa.

Metodos directos.

1.- Tradicionales :

A) Observación Microscopica:
Podemos distinguir dos tipos diferentes de muestras biológicas:

• Preparaciones en fresco o in vivo.
  Las preparaciones al fresco son muy fáciles de preparar; se prepara una disolución acuosa donde se introduce el microorganismo, se pone una gota en un porta, se tapa con un cubre y se observa. Se emplean para observar la morfología de bacterias, especialmente de espiroquetas. Sirve también para observar la movilidad de las bacterias y para observar cambios citológicos; mitosis, esporulación, etc. También sirve para observar inclusiones (grasas, etc.)
  Ejemplos
  - Suero fisiológico: demostrar la presencia de Tricomonas y Treponemas.
  - Solución de KOH (10%): identificación de Hongos.
  - Tinta china: El frotis se hace con la nigrosina; no hay que fijarla (por eso no se considera a la tinta china como tinción). Nos sirve para observar la cápsula de bacterias, indicadora de virulencia. Esta técnica se utiliza principalmente para identificación del Cryotococcus Neoformans.

• Preparaciones fijadas y teñidas.
  Las preparaciones fijadas y teñidas son las más utilizadas en Microbiología por dos razones:
  - La tinción facilita la visualización de la bacteria
  - Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.
  La mayor desventaja es que la bacteria ya está muerta.
  
  
  

- Tinción Simple: con azul de metileno. Todas las bacterias aparecen teñidas de azul.

- Tinción de Ziehl-Neelsen: Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Preparación:

En “caliente”:
Hacer un frotis de la muestra de esputo.
Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada.
Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Decolorar con alcohol-ácido.
Aplicar azul de metileno (1 minuto).
Enjuagar con agua

En "frío":
Hacer un frotis.
Dejarlo en el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).
Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
Decolorar con alcohol acido.
Lavar con agua del grifo.
Contrastar con azul de metileno
Resultados: BAAR: rojo. Núcleos: azul.

- Tinción de Gram: Debe su nombre al Bacteriologo Danés Christian Gram que la desarrollo en 1844. Es una tinción diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y Gram -, de acuerdo a las propiedades de su pared celular:
Preparación:
1º Fijamos la muestra mediante calor.
2º Violeta cristal (Tiñe todas las baterías, gram + y -) 1´´
3º Fijamos con Lugol, 1´.
4º Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona (los gram - se decoloren).10´´
5º Safranina (colorante de contraste, tiñe a los gram -), 30´´
Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo. En la tinción se observarán de color azul-violeta las gram + y de color rosa las gram -.

Se observan estreptococos gram + y bacilos gram -.

- Tinción de Wirtz-Conklin: Principalmente se utiliza para bacterias Clostridium y Bacillus.
Preparación:
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Añadir más colorante si la muestra se seca.
3. Lavar con agua el resto de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al microscopio.



















B) Cultivo: muy importante para poder identificar un microorganismo es observar su crecimiento en sustancias alimenticias preparadas artificialmente.


El material alimenticio es el Medio de cultivo (Ej.: Agar Sabouraud: ). Y el crecimiento del microorganismo es el Cultivo (Ej.: cultivo de Hongos)


Los medios de cultivos deben cumplir ciertas condiciones para que se produzca el adecuado crecimiento del microorganismo, como por ejemplo: luz, temperatura, grado de humedad, presión de oxígeno, acidez, alcanilidad.


Según el estado del medio de cultivo se clasifican en:
- Medios sólidos: su proporción de Agar es por encima del 15%
- Medios semisólidos: su proporción de Agar es de aprox. un 5%
- Medios líquidos: no contienen Agar. Ej.: caldos











El agar es una sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o Rodofíceas, frecuentes en el Océano Atlántico, Pacífico e Indico. Es una sustancia amorfa. Se emplea como medio de cultivo en bacteriología, como apresto de sedas, como sustituto de la gelatina, etc.



Medios y Cultivos

- Agar nutritivo: promueve el crecimiento de microorganismos poco exigentes.


- Agar de Chapman: se utiliza principalmente para el crecimiento de Staphylococcus

- Agar de Sabouraud: Se utiliza para el cremiento de Hongos.







- Agar de Sangre: se utiliza para el creciemtno de una gran variedad de microorganismos. Determina reacciones hemolíticas.















- Hemocultivo: se utiliza en la sospecha de una bacteremia.

- Urocultivo: destinado a la infección urinaria.

- Coprocultivo: búsqueda de patógenos intestinales productores de enterocolitis aguda,etc.


C) Identificación:
Para la identificación del microorganismo tenemos muchos métodos tanto microbiológicos como inmunoquímicos.

1. Examen microscópico: observación directamente del microscopio lo que nos permite analizar la morfología, la tinción, el número de bacterias presentes y la movilidad en casos de preparaciones en fresco.

2. Cultivo de la muestra: debe utilizarse un medio de cultivo adecuado al patógeno sospechoso. Una vez desarrolladas las colonias, se hará un aislamiento de ellas por difusión o dilusion. Se analiza el aspecto de la colonia: tamaño, forma, pigmento, bordes, consistencia, etc.



3. Pruebas bioquímias para identificar la bacteria: una vez aislada la bacteria se sembrará en los correspondientes medios de cultivo selectivos e indicadores, de acuerdo a la sospecha que tenga sobre el tipo de patógeno que se trata
A través de los cultivos en estos medios indicadores, se verá la acción fisiológica de la bacteria, lo que guiará a hacer un diagnostico de ella.

• Pruebas de sensibilidad ante los antimicrobianos(antibiogramas)se relizan por lo general antibiogramas por difusión para determinar al susceptibilidad del patógeno frente a una serie de antimicrobianos, lo que es una guía para realizar la terapia. Son complementarias a la identificación de microorganismos, porque un agente antimicrobiano puede servir para varias bacterias (no diferencia totalmente a la bacteria).