domingo, 31 de mayo de 2009

Introducción

La toma de muestra es procedimiento especializado que consiste en la obtención de uno o varios especímenes biológicos con el fin de determinar y aislar él o los agentes etiológicos de una probable infección a fin de apoyar al médico clínico en la confirmación diagnóstica, la elección de la terapia antimicrobiana y la conducta epidemiológica a tomar frente al paciente y su entorno.
Estos agentes son seres vivos que al retirarlos de su ambiente habitual, rápidamente pierden su viabilidad. Las principales causas de esta pérdida son: CAÍDA DE LA TEMPERATURA, DESECACIÓN y CAÍDA DEL pH.

Para evitar la pérdida deÍ viabilidad y obtener el máximo rendimiento en los exámenes microbiológicos se debe acortar al mínimo el tiempo que media entre la extracción de la muestra y su posterior siembra en el medio de cultivo específico en el laboratorio. Es preferible que la toma de muestra sea previa al inicio del tratamiento antibiótico, ya que éste inhibe el crecimiento bacteriano.
Debido a la importancia de estos procesos en la actualidad presentamos en este blog la información necesario con respecto a la toma de muestras y el diagnostico microbiológico.

viernes, 29 de mayo de 2009

Principales tomas de muestras y medios de transportes.

1.- Principales muestras clínicas útiles para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa:

Entre las que encontramos:
Sangre
Orina
Expectoración y lavado broncoalveolar
Secreción de herida
LCR

Otras: Heces
Secreciones urogenitales
Biopsia y materiales aspirados.




2.- Condiciones generales para la toma y transporte correcto de las muestras:

En cuanto a la toma de muestra se debe considerar:
Las muestras deben obtenerse preferentemente antes de comenzar la terapia con antibióticos o bien antes de introducir cualquier modificación al tratamiento con antimicrobianos.
La muestra obtenida no debe presentar contaminación con flora habitual, o ésta debe ser la mínima posible.
Se debe usar material estéril en la obtención de muestra y realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales, del personal médico y del propio enfermo.
Coleccione un apropiado volumen de muestra. Ya que insuficiente material puede disminuir su rendimiento y ser causa de resultados falso-negativos.
Anote en el formulario cualquiera información de interés, tales como si el paciente es inmunosuprimido o si recibe drogas inmunosupresoras, si recibe antibióticos, diagnóstico presuntivo, interés en algún germen, etc.
Seleccione el tipo anatómico correcto donde se obtendrá el espécimen, y utilice la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención.

En cuanto el cumplimiento del volante:
- Las muestras deben ser identificadas con una etiqueta adherida al envase, y los datos anotados deben coincidir exactamente con los de la solicitud de examen dado por el médico tratante.

· Deben incluirse aquellos datos del paciente que permitan al laboratorio elegir el mejor procedimiento para el aislamiento de patógenos, tales identificación del paciente, identificación del médico tratante, hipótesis diagnóstica, tratamientos (especialmente antibióticos), datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra, localización anatómica, procedimiento de obtención de la muestra). Entre otras.

En cuanto la identificación del volante :
Cada muestra debe estar acompañada siempre de un volante.

· El recipiente debe identificarse con nombre y apellidos, tipo de muestra, fecha, y hora de extracción.
· El volante y el sobre deberán tener etiqueta de color según su conservación:
- Rojo: en estufa.
-Azul: en nevera.
-Amarillo: a Temperatura ambiente




3- Medios de transportes:

Los medios de transporte están formulados para mantener la viabilidad de los microorganismos, sin embargo, algunos podrían no sobrevivir en un medio pobre en elementos nutricionales específicos.

El transporte de las muestras debe de garantizar el buen manejo y custodia de la muestra para evitar la degradación, por lo tanto es importante que el transporte tome en cuenta condiciones de tiempo de transporte, refrigeración u oscuridad requerida según corresponda.

La mayoría de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en su procesamiento, cambios de temperatura, humedad, etc. Durante el transporte las bacterias de rápido crecimiento, pueden crecer sobre los patógenos más fastidiosos por lo que todas las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio después de colectadas.
Se debe instruir al personal médico, de enfermería y mensajeros en la importancia de un transporte expedito de las muestras clínicas.

En los casos en que el transporte o el proceso pudieran demorar, se establecen a continuación las condiciones de temperatura para algunos tipos de muestras:

- Mantenimiento a 4 °C:
Tejido de autopsia, lavado bronquial, biopsia de pulmón, líquido pericardio, orina., Quemaduras, oído externo.

- Mantenimiento a temperatura ambiente :
LCR, Líquido sinovial, abdominal ,amniótico, bilis, aspirado de pulmón, lesión, nasal, aspirado transtraqueal, sangre, humor vítreo, médula ósea, cérvix, conjuntiva, genitales, heces, tracto respiratorio superior y heridas entre otras.

En general no guarde una muestra por más de 24h bajo ninguna condición.
Sin embargo, los virus permanecen estables por 2 a 3 días en medios de transporte apropiados.

Para el transporte de muestras tenemos:
a)-. Para tejidos y órganos:

Se utilizan bolsas plásticas limpias y cerradas herméticamente ó en frascos de vidrio hervidos durante 15 minutos y cerrados con tapa metálica.
Ambos envases deben ser colocados en cajas de plumavit o neveras portátiles con abundante cantidad de hielo en bolsas cerradas o bien usar el sistema Ice-Pak disponible en el comercio. No deben congelarse ni sumergirse en soluciones químicas tal como formalina ya que producen muerte bacteriana.



b).- Para muestras líquidas y secreciones:

Se utilizan preferentemente tórulas ó hisopos estériles disponibles en el comercio.
Es importante recalcar que la tórula debe ser enviada en el interior de un tubo estéril para evitar su contaminación.
Si la secreción está contenida en el interior de un tejido, debe extraerse mediante punción con una jeringa estéril. La sangre puede enviarse en la misma jeringa o bien traspasarla lentamente (sin aguja) a un tubo de vidrio.



4.- Entre algunos medios de transportes tenemos:

-Envase estéril de boca ancha:
· Para: biopsias, tejidos, orina, escamas, líquidos, esputos, secreciones
bronquiales.
· Estudia: micobacterias, aerobios, hongos, antígeno y neumococo.

- Tubo de plástico estéril:
· Para: catéteres (no más de 4 cm), tejidos y líquidos.
· Estudia: aerobios, hongos, micobacterias.
· Precisa 3-4 ml por frasco.

- Tubo estéril de tapón verde:
· Para: líquidos estériles.
· Estudia: micobacterias, aerobios y hongos.
· No válido para: anaerobios, ni para líquidos con alto contenido hemático.


- Hemocultivos adultos:
· Para: sangre y líquidos estériles.
· Estudia: aerobios, anaerobios y hongos levaduriformes.
· Precisa 10 ml por frasco.

- Hemocultivos pediátricos:
· Para: sangre y líquidos estériles.
· Estudia: aerobios y hongos.


- Contenedor especial Para-Pak:


· Para: heces.
· Estudia: aerobios , hongos., Rotavirus.


- Hisopo con medio de transporte Stuart:

· Para: abscesos y heridas recogidas con escobillón.
· Estudia: aerobios y hongos.
· No válido para: anaerobios y micobacterias.
· Este fijador (jalea celeste) no es nutritivo por esta cualidad impide el crecimiento acelerado de otra flora bacteriana y la reproducción del microorganismo presente.



- Torulas:


Es el medio de transporte del coprocultivo con ayuda del fijador Cary Blair (jalea blanca) este medio también se usa en:

Port-A-Cul vial (medio Cary Blair):
· Para: líquidos y exudados obtenidos por aspiración
· Estudia: aerobios, anaerobios, hongos y micobacterias.

Port-A-Cul tubo (medio de Cary Blair):
· Para: raspados de heridas, escaras, abscesos, úlceras, pequeñas biopsias y
tejidos.
· Estudia: aerobios, anaerobios y hongos.

El fijador Cary Blair tiene bajo contenido de nutrientes (lo que ayuda a la recuperación del microorganismo impidiendo su replicación), bajo potencial de oxido-reducción (ya que contiene tioglicolato), y un alto PH (minimiza la muerte bacteriana).

Condiciones generales, extracción, transporte y conservación de las principalesmuestras muetras

La extracción de muestras de tejidos y/o secreciones se realizan con el fin de determinar y cuantificar la posible presencia de microorganismos en algún sector del cuerpo. Los procedimientos para la extracción de sangre, líquido cefalo-raquídeo, secreciones de heridas, etc. son realizados por profesionales calificados, como médicos, enfermeras (os), técnicos en enfermería, etc., pero en otras extracciones como la de orina y heces los pacientes son instruidos para que estos obtengan la muestra. Estas muestras  son enviadas al laboratorio en su respectivo transporte para mantenerlas en un ambiente adecuado respecto a los microorganismos que se desean estudiar, por lo tanto hay que tener presente el tipo de microorganismo al que se le realizara el estudio bacteriológico. Si no es posible enviar las muestras al laboratorio inmediatamente hay que conservarlas en un ambiente adecuado según sus requerimientos, por ejemplo las heces fecales se pueden refrigerar máximo 2 horas, la sangre hay que mantenerla a temperatura ambiente, etc.  

  Estos cuidados en la extracción, transporte y mantención permiten realizar el estudio con la obtención de resultados precisos acerca de la posible presencia de un microorganismo en una determinada parte del cuerpo. 


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Para obtener información más detallada hacer de los exámenes de sangre, orina, expectoración, lavado broncoalveolar, secreción de herida, líquido céfalo-raquídeo y deposiciones, se recomienda bajar el documento "Principales muestras clínicas" del siguiente link:http://rapidshare.com/files/240598662/Principales_muestras_cl_nicas__seminario4_.doc.html 
 

Métodos de diagnóstico microbiológico

Existen 2 métodos de diagnóstico microbilógico: los directos y los indirecto.

Los métodos directos tienen como objetivo primordial identificar al microorganismo específico que está causando el daño o la patología, mientras que los métodos indirectos buscan la manifestacion de una patología basado en la respuesta del sistema inmune, con la busqueda de antígenos o anticuerpos.

Según su clasificación podemos encontrar:

A. Métodos Directos:

I Tradicionales.

- Observación microscópica.
- Cultivo.
- Identificación.

II Moleculares.

- Hibridizacion
- P.C.R.

III Detección de antígenos:

- Inmunofluorescencia directo
- Elisa directo

B. Métodos indirectos:

- I. F.
- Elisa.

Metodos directos.

1.- Tradicionales :

A) Observación Microscopica:
Podemos distinguir dos tipos diferentes de muestras biológicas:


  • Preparaciones en fresco o in vivo.
    Las preparaciones al fresco son muy fáciles de preparar; se prepara una disolución acuosa donde se introduce el microorganismo, se pone una gota en un porta, se tapa con un cubre y se observa. Se emplean para observar la morfología de bacterias, especialmente de espiroquetas. Sirve también para observar la movilidad de las bacterias y para observar cambios citológicos; mitosis, esporulación, etc. También sirve para observar inclusiones (grasas, etc.)
    Ejemplos
    - Suero fisiológico: demostrar la presencia de Tricomonas y Treponemas.
    - Solución de KOH (10%): identificación de Hongos.
    - Tinta china: El frotis se hace con la nigrosina; no hay que fijarla (por eso no se considera a la tinta china como tinción). Nos sirve para observar la cápsula de bacterias, indicadora de virulencia. Esta técnica se utiliza principalmente para identificación del Cryotococcus Neoformans.
  • Preparaciones fijadas y teñidas.
    Las preparaciones fijadas y teñidas son las más utilizadas en Microbiología por dos razones:
    - La tinción facilita la visualización de la bacteria
    - Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.
    La mayor desventaja es que la bacteria ya está muerta.


- Tinción Simple: con azul de metileno. Todas las bacterias aparecen teñidas de azul.

- Tinción de Ziehl-Neelsen: Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Preparación:

En “caliente”:
Hacer un frotis de la muestra de esputo.
Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada.
Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Decolorar con alcohol-ácido.
Aplicar azul de metileno (1 minuto).
Enjuagar con agua


En "frío":
Hacer un frotis.
Dejarlo en el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).
Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
Decolorar con alcohol acido.
Lavar con agua del grifo.
Contrastar con azul de metileno
Resultados: BAAR: rojo. Núcleos: azul.

- Tinción de Gram: Debe su nombre al Bacteriologo Danés Christian Gram que la desarrollo en 1844. Es una tinción diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y Gram -, de acuerdo a las propiedades de su pared celular:
Preparación:
1º Fijamos la muestra mediante calor.
2º Violeta cristal (Tiñe todas las baterías, gram + y -) 1´´
3º Fijamos con Lugol, 1´.
4º Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona (los gram - se decoloren).10´´
5º Safranina (colorante de contraste, tiñe a los gram -), 30´´
Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo. En la tinción se observarán de color azul-violeta las gram + y de color rosa las gram -.

Se observan estreptococos gram + y bacilos gram -.

- Tinción de Wirtz-Conklin: Principalmente se utiliza para bacterias Clostridium y Bacillus.
Preparación:
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Añadir más colorante si la muestra se seca.
3. Lavar con agua el resto de colorante.
4. Teñir con safranina 1 min.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la preparación al microscopio.



















B) Cultivo: muy importante para poder identificar un microorganismo es observar su crecimiento en sustancias alimenticias preparadas artificialmente.


El material alimenticio es el Medio de cultivo (Ej.: Agar Sabouraud: ). Y el crecimiento del microorganismo es el Cultivo (Ej.: cultivo de Hongos)


Los medios de cultivos deben cumplir ciertas condiciones para que se produzca el adecuado crecimiento del microorganismo, como por ejemplo: luz, temperatura, grado de humedad, presión de oxígeno, acidez, alcanilidad.


Según el estado del medio de cultivo se clasifican en:
- Medios sólidos: su proporción de Agar es por encima del 15%
- Medios semisólidos: su proporción de Agar es de aprox. un 5%
- Medios líquidos: no contienen Agar. Ej.: caldos











El agar es una sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o Rodofíceas, frecuentes en el Océano Atlántico, Pacífico e Indico. Es una sustancia amorfa. Se emplea como medio de cultivo en bacteriología, como apresto de sedas, como sustituto de la gelatina, etc.



Medios y Cultivos

- Agar nutritivo: promueve el crecimiento de microorganismos poco exigentes.


- Agar de Chapman: se utiliza principalmente para el crecimiento de Staphylococcus

- Agar de Sabouraud: Se utiliza para el cremiento de Hongos.







- Agar de Sangre: se utiliza para el creciemtno de una gran variedad de microorganismos. Determina reacciones hemolíticas.















- Hemocultivo: se utiliza en la sospecha de una bacteremia.

- Urocultivo: destinado a la infección urinaria.

- Coprocultivo: búsqueda de patógenos intestinales productores de enterocolitis aguda,etc.


C) Identificación:
Para la identificación del microorganismo tenemos muchos métodos tanto microbiológicos como inmunoquímicos.

1. Examen microscópico: observación directamente del microscopio lo que nos permite analizar la morfología, la tinción, el número de bacterias presentes y la movilidad en casos de preparaciones en fresco.

2. Cultivo de la muestra: debe utilizarse un medio de cultivo adecuado al patógeno sospechoso. Una vez desarrolladas las colonias, se hará un aislamiento de ellas por difusión o dilusion. Se analiza el aspecto de la colonia: tamaño, forma, pigmento, bordes, consistencia, etc.



3. Pruebas bioquímias para identificar la bacteria: una vez aislada la bacteria se sembrará en los correspondientes medios de cultivo selectivos e indicadores, de acuerdo a la sospecha que tenga sobre el tipo de patógeno que se trata
A través de los cultivos en estos medios indicadores, se verá la acción fisiológica de la bacteria, lo que guiará a hacer un diagnostico de ella.

  • Pruebas de sensibilidad ante los antimicrobianos(antibiogramas)se relizan por lo general antibiogramas por difusión para determinar al susceptibilidad del patógeno frente a una serie de antimicrobianos, lo que es una guía para realizar la terapia. Son complementarias a la identificación de microorganismos, porque un agente antimicrobiano puede servir para varias bacterias (no diferencia totalmente a la bacteria).

Detección de antígenos – anticuerpos

Hibridación: El ADN es una estructura de doble cadena que tiene la capacidad des desnaturalizarse ante el calor, rompiendo los puentes de hidrogeno entre sus base y de aparear estas cadenas ante la exposición del frio (re naturalización). A partir de esta propiedad es que se ha creado esta técnica de diagnostico microbiológico, más conocida como hibridación. La técnica consiste en la detección de microorganismos. Recordemos que estos cuentan con su propio ácidos nucleído, lo que permite distinguirlos a través de un fragmento de acido nucleído sintetizado y marcado, denominado SONDA, que posee una secuencia complementaria a las secuencias especificas buscada. Esta sonda además puede ser marcada con sustancias radioactivas, fluorescente u otros marcadores.

Esta tecnología puede utilizarse con ventaja en la caracterización de aquellos microorganismos responsables de un brote epidémico, precisando en esa forma su pertenencia a una misma cepa, así como también define la epidemiología de las infecciones.

Procedimiento experimental

1. La doble hélice de ADN del microorganismo en estudio es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte).

2. La sonda marcada es añadida junto con las cadenas de ADN.

3. El ADN es enfriado, lo que permite el apareamiento de las bases complementarias. Este proceso también incluye la hibridación del la sonda con alguna cadena especifica de ADN

Además existen dos tipos de hibridación, la cual varía según el tipo de acido nucleíco involucrado.

Southern blot → identifica microorganismos con ADN
Northern blot → identifica microorganismos con ARN


PCR “Polymerase Chain Reaction”

Creado en el año 1985 por Kari B. Mullis. Este método consiste en la obtención de fragmentos específicos de ADN o ARN en cortos periodos de tiempo.

Para realizar esta técnica se requieren de los siguientes componentes

• DNA a amplificar
• Primers→ Son fragmentos de DNA sintético de corta longitud (~ 20 nucleótidos). Enmarcan la secuencia a copiar. Se sintetiza de manera artificial en laboratorios especializados. Se diseñan de manera que sean complementarios a una secuencia conocida del fragmento a amplificar.
• Taq → Es una polimerasa que se obtiene de la bacteria Thermophilus aquaticus. Esta bacteria vive en medios a 50-80°C, lo cual permite la obtención de una polimerasa que se capaz de resistir las altas temperaturas.
• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa
• Solución salina con Mg2+→ permite el funcionamiento de la polimerasa

Los “ingredientes” de la reacción deben ser capaces de soportar altas temperaturas.

Etapas del proceso:

1. Desnaturalización (30 segundos a 95°C)→ Separación del las hebras de ADN

2. Anillado (Anneal) (30 segundos a 60°C)→ Al disminuir la temperatura, los primer son capaces de unirse por complementariedad a las hebras de ADN, las cuales se sitúan en cada extremo del enmarcando la secuencia del fragmento a copiar.

3. Extensión o alargamiento (45 segundos a 72°C)→ La polimerasa replica el ADN a partir de los cebadores unidos a ambas cadenas.

El fragmento amplificado recibe el nombre de “amplicor”

La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador, aparato capaz de producir las temperaturas requeridas

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I. F. (Inmunofluorescencia)

Estas son pruebas que permiten identificar microorganismos y detectar la presencia de anticuerpos específicos o antígenos en suero, secreciones tejidos u otros tipos de muestras del paciente. Estas pruebas son rápidas, muy sensibles y especificas. Tienen amplia aplicación en el diagnostico de enfermedades infecciosas.
IF directa (IFD): Se utilizan para identificar microorganismos. Se realiza a través de los siguientes pasos:
1. La muestra problema (del paciente) se fija sobre un portaobjetos
2. Lavado de la muestra, para eliminar los antígenos no fijados.
3. Sobre la muestra se agrega un volumen fijo de anticuerpos específicos para el microorganismo en estudio. Estos anticuerpos llevan unido un colorante fluorescente que bajo luz ultravioleta se ilumina, conocido como ISOTIOCIANATO DE FLUORESCINA (FITC). La mezcla en el portaobjetos es incubada. Ocurre reacción antígeno-anticuerpo.
4. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al antígeno.
5. Después de colocarle un cubre objeto, se observa bajo luz ultravioleta para detectar la presencia y/o titulo de un anticuerpo especifico en un suero problema. Si hay unión antígeno-anticuerpo, los microorganismos se verán iluminados en la microscopia UV.


IF indirecta (IFI): esta variante de IF, pero que en vez de identificar antígenos mide la cantidad de anticuerpos de una muestra. Para ello, hay que realizar los siguientes pasos:
1. La muestra problema se fija sobre un portaobjetos.
2. Lavado de la muestra, para eliminar los antígenos no fijados.
3. Sobre la muestra se agrega un volumen fijo de anticuerpos específicos para el microorganismo en estudio (provenientes del paciente), que a diferencia de la IFD no se encuentran marcados. Ocurre reacción antígeno-anticuerpo.
4. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al antígeno.
5. Se agrega un anticuerpo anti inmunoglobulina previamente marcado (con isotiocianato de fluorescina). La mezcla en el portaobjetos es incubada. Ocurre reacción anticuerpo anti inmunoglobulina-anticuerpo.
6. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al anticuerpo anti inmunoglobulina.
7. Después de colocarle un cubre objeto, se observa bajo luz ultravioleta para detectar la presencia de anticuerpos especifico. Si hay unión anticuerpo anti inmunoglobulina-anticuerpo, la muestra se verá iluminada en el microscopio de fluorescencia, la cual dependerá del volumen de los anticuerpos generados.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Actua de forma similar a la I.F, pero en vez de utilizar como marcador el isotiocianato utiliza una enzima, la cual reacciona específicamente con un sustrato y el resultado es la producción de color. Esta técnica detecta una amplia variedad de agentes infecciosos.

Existen 2 tipos:

ELISA Directo:

Consta de las siguientes etapas:

a) Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
b) Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
c) Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
d) Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Indirecto.

Consta de las siguientes etapas:

a) Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

b) Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

c) Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

d) Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.