viernes, 29 de mayo de 2009

Detección de antígenos – anticuerpos

Hibridación: El ADN es una estructura de doble cadena que tiene la capacidad des desnaturalizarse ante el calor, rompiendo los puentes de hidrogeno entre sus base y de aparear estas cadenas ante la exposición del frio (re naturalización). A partir de esta propiedad es que se ha creado esta técnica de diagnostico microbiológico, más conocida como hibridación. La técnica consiste en la detección de microorganismos. Recordemos que estos cuentan con su propio ácidos nucleído, lo que permite distinguirlos a través de un fragmento de acido nucleído sintetizado y marcado, denominado SONDA, que posee una secuencia complementaria a las secuencias especificas buscada. Esta sonda además puede ser marcada con sustancias radioactivas, fluorescente u otros marcadores.

Esta tecnología puede utilizarse con ventaja en la caracterización de aquellos microorganismos responsables de un brote epidémico, precisando en esa forma su pertenencia a una misma cepa, así como también define la epidemiología de las infecciones.

Procedimiento experimental

1. La doble hélice de ADN del microorganismo en estudio es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte).

2. La sonda marcada es añadida junto con las cadenas de ADN.

3. El ADN es enfriado, lo que permite el apareamiento de las bases complementarias. Este proceso también incluye la hibridación del la sonda con alguna cadena especifica de ADN

Además existen dos tipos de hibridación, la cual varía según el tipo de acido nucleíco involucrado.

Southern blot → identifica microorganismos con ADN
Northern blot → identifica microorganismos con ARN


PCR “Polymerase Chain Reaction”

Creado en el año 1985 por Kari B. Mullis. Este método consiste en la obtención de fragmentos específicos de ADN o ARN en cortos periodos de tiempo.

Para realizar esta técnica se requieren de los siguientes componentes

• DNA a amplificar
• Primers→ Son fragmentos de DNA sintético de corta longitud (~ 20 nucleótidos). Enmarcan la secuencia a copiar. Se sintetiza de manera artificial en laboratorios especializados. Se diseñan de manera que sean complementarios a una secuencia conocida del fragmento a amplificar.
• Taq → Es una polimerasa que se obtiene de la bacteria Thermophilus aquaticus. Esta bacteria vive en medios a 50-80°C, lo cual permite la obtención de una polimerasa que se capaz de resistir las altas temperaturas.
• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa
• Solución salina con Mg2+→ permite el funcionamiento de la polimerasa

Los “ingredientes” de la reacción deben ser capaces de soportar altas temperaturas.

Etapas del proceso:

1. Desnaturalización (30 segundos a 95°C)→ Separación del las hebras de ADN

2. Anillado (Anneal) (30 segundos a 60°C)→ Al disminuir la temperatura, los primer son capaces de unirse por complementariedad a las hebras de ADN, las cuales se sitúan en cada extremo del enmarcando la secuencia del fragmento a copiar.

3. Extensión o alargamiento (45 segundos a 72°C)→ La polimerasa replica el ADN a partir de los cebadores unidos a ambas cadenas.

El fragmento amplificado recibe el nombre de “amplicor”

La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador, aparato capaz de producir las temperaturas requeridas



I. F. (Inmunofluorescencia)

Estas son pruebas que permiten identificar microorganismos y detectar la presencia de anticuerpos específicos o antígenos en suero, secreciones tejidos u otros tipos de muestras del paciente. Estas pruebas son rápidas, muy sensibles y especificas. Tienen amplia aplicación en el diagnostico de enfermedades infecciosas.
IF directa (IFD): Se utilizan para identificar microorganismos. Se realiza a través de los siguientes pasos:
1. La muestra problema (del paciente) se fija sobre un portaobjetos
2. Lavado de la muestra, para eliminar los antígenos no fijados.
3. Sobre la muestra se agrega un volumen fijo de anticuerpos específicos para el microorganismo en estudio. Estos anticuerpos llevan unido un colorante fluorescente que bajo luz ultravioleta se ilumina, conocido como ISOTIOCIANATO DE FLUORESCINA (FITC). La mezcla en el portaobjetos es incubada. Ocurre reacción antígeno-anticuerpo.
4. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al antígeno.
5. Después de colocarle un cubre objeto, se observa bajo luz ultravioleta para detectar la presencia y/o titulo de un anticuerpo especifico en un suero problema. Si hay unión antígeno-anticuerpo, los microorganismos se verán iluminados en la microscopia UV.


IF indirecta (IFI): esta variante de IF, pero que en vez de identificar antígenos mide la cantidad de anticuerpos de una muestra. Para ello, hay que realizar los siguientes pasos:
1. La muestra problema se fija sobre un portaobjetos.
2. Lavado de la muestra, para eliminar los antígenos no fijados.
3. Sobre la muestra se agrega un volumen fijo de anticuerpos específicos para el microorganismo en estudio (provenientes del paciente), que a diferencia de la IFD no se encuentran marcados. Ocurre reacción antígeno-anticuerpo.
4. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al antígeno.
5. Se agrega un anticuerpo anti inmunoglobulina previamente marcado (con isotiocianato de fluorescina). La mezcla en el portaobjetos es incubada. Ocurre reacción anticuerpo anti inmunoglobulina-anticuerpo.
6. Lavado para eliminar todo el conjugado no unido al anticuerpo anti inmunoglobulina.
7. Después de colocarle un cubre objeto, se observa bajo luz ultravioleta para detectar la presencia de anticuerpos especifico. Si hay unión anticuerpo anti inmunoglobulina-anticuerpo, la muestra se verá iluminada en el microscopio de fluorescencia, la cual dependerá del volumen de los anticuerpos generados.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Actua de forma similar a la I.F, pero en vez de utilizar como marcador el isotiocianato utiliza una enzima, la cual reacciona específicamente con un sustrato y el resultado es la producción de color. Esta técnica detecta una amplia variedad de agentes infecciosos.

Existen 2 tipos:

ELISA Directo:

Consta de las siguientes etapas:

a) Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
b) Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
c) Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
d) Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Indirecto.

Consta de las siguientes etapas:

a) Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

b) Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

c) Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

d) Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

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